OriGene Technologies, Inc.
  邮箱:  密码: 忘记密码?
注册 | 购物车 | 主页
搜索:    
About FL cDNA Clones RNAi Gene Expression Lysates and Proteins Antibodies Tissue IVD 原料 Other Products Tech Support
orange

Video overview of cDNA clone
offering
Video brochure for cDNA clone
OriGene shRNA in recent publications

产品应用

RNAi 和 OriGene HuSH

RNA抑制是一种基因沉默现象,在此过程,双链RNAs导致同源mRNA降解。特定的dsRNAs 被剪切成小的干扰RNA (siRNA), 它引导了RNA诱导的沉默复合体(RISC)剪切同源mRNA。靶 mRNA的降解导致了目标基因的特异性抑制。

OriGene 构建了一整套的RNAi产品, HuSH,以满足基因沉默的需要。一旦转进宿主细胞,HuSH 组分表达基因特异性的短发卡RNA,将和RNA诱导的沉默复合体一起降解靶mRNA并沉默基因。

RNAi 常被用于解决如下问题,例如基因功能,通路研究, 基因验证和蛋白表达分析, 以及疾病相关基因转录前后功能研究。 很多方法可以测定RNAi 对细胞的影响,包括mRNA水平测定,蛋白水平检测和细胞功能检测。选择合适的RNAi检测途径对判定基因沉默效应十分重要。

RNAi 检测

成功抑制基因秘诀

解决您的基因沉默问题

方法和流程

RNAi 检测

用 qRT-PCR (定量反转录聚合酶连锁反应) 检测mRNA水平,敏感快捷。 QRT-PCR提供了细胞样本中的未降解mRNA在转录前水平的检测。 检测的mRNA 水平,被shRNA抑制的要低于未处理的对照样品。

检测 RNAi 效果最常见的方法是蛋白表达水平的western blot鉴定。 用沉默基因对用的蛋白特异性抗体,可以检测转录后的沉默水平。 细胞裂解物跑胶,可根据大小分离蛋白。蛋白转膜,然后和抗体反应。如果RNAi抑制后,检测的蛋白含量低于未处理的对照样品,说明基因沉默成功。

细胞功能检测是一个常用的方法,以检测细胞增殖增加或减少,凋亡,或更复杂的表型变化。有许多商业上可用的试剂盒,可用于测量细胞增殖和凋亡。表型检测通常需要更复杂和专门的评估方法,如通过一个已知途径的功能或其他反应。

和报告基因共转染,如luciferase或GFP,可以优化shRNA转染或感染效果。市场上还提供验证载体可以在shRNA表达的细胞中产生反向信号。由于RNA干扰的机制,在shRNA表达的过程中,报告元件被损坏。

成功抑制宝典

一个有效的和成功的抑制试验取决于几个关键因素:良好的靶向序列的设计,高品质的DNA,高效率的沉默载体,转染方法,包括适当的对照,以及对抑制的测定方法。为了正确地控制和检测您的抑制试验,请考虑以下几点。

使用抗生素筛选

利用pRS嘌呤霉素筛选标记的优势,产生稳定的细胞株,可以确保得到正确的数据。瞬时转染并不能保证表达shRNA的细胞比例很高。这可以简化数据分析和消除大量的实验误差。

使用阴性对照

对于任何shRNA的实验中,重要的是要证明一个靶向效果是基因特异性的,而不是由于非特异性作用,如干扰素应答或脱靶沉默。我们的阴性对照质粒可用于排除这些非特异性反应。

所有OriGene 的shRNA的产品包括两个阴性对照。一个是原始的pRS空载体(TR20003),另一种是无效的shGFP对照(TR30003),它将一个shRNA序列克隆到相同的pRS载体。使用一个空载体可以表明,沉默的效果不是因为干扰素应答。无效shGFP质粒表达发夹shRNA,可作为基因特异性抑制反应的对照。

请在所有的实验都使用两种阴性对照,以对比基因特异性shRNA载体的影响。一个有效的测试包括两个阴性对照质粒的使用。只用其中一个阴性对照或简单的使用未转染的亲本细胞作对照,都是不明智的。因为转染对细胞的影响,会导致显著的检测偏差。

使用阳性对照

抗绿色荧光蛋白(GFP)和荧光素酶(Luc)的shRNA表达载体(产品编号分别为TR30001和TR30002),可以购买用作抑制实验的阳性对照。shRNA-GFP和 shRNA-Luc构建在相同的质粒载体pRS上,已经证实对他们的相应靶基因的抑制效果达90%。当和GFP或 luciferase表达质粒共转染时,阳性对照可以用来验证建立针对您的细胞的shRNA抑制试验的最佳转染条件。

to use as knockdown controls for your experiments. Both shRNA-GFP and shRNA-Luc are constructed in the same plasmid vector, pRS, and have been shown to inhibit their respective

target genes by up to 90%. When co-transfected with GFP or luciferase expressing plasmids, these positive controls are readily assayed for establishment of the optimal transfection conditions for shRNA silencing in your cells.

抑制效果检测

很多方法可以检测基因抑制效果。内参基因有助于评估和验证特异基因的抑制效果,常用的如GAPDH,肌动蛋白,微管蛋白。基因抑制检测常用方法如qRT-PCR和Western blot分析,这些都是经典方法。

方法和流程

质粒扩增

特异性shRNA真核细胞转染简介

通过转染构建表达特异性shRNA的稳定细胞系

shRNA经逆转录病毒感染细胞

HuSH手册

相关产品

阳性和阴性对照

 

全国免费电话:400-6744-363(手机),800-9904-363(座机)订货邮箱:orderscn@origene.com,techsupport@origene.cn
电话:+86-10-59755312 传真:+86-10-59755322-888 地址:北京市经济技术开发区科创14街99号汇龙森科技园11栋
京ICP证07031721号 Copyright © 2017 北京傲锐东源(OriGene Technologies)生物科技有限公司,All Rights Reserved. 法律声明.