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OriGene联合CELL杂志共同出版的
CRISPR论文集
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OriGene cDNA clones in recent publications
Epilepsy-associated GRIN2A mutations reduce NMDA receptor trafficking and agonist potency - molecular profiling and functional rescue Sci Rep 2017 [GRIN2A]

Matrix metalloproteinase processing of PTHrP yields a selective regulator of osteogenesis, PTHrP1-17 Oncogene 2017 [PTH1R]

Whole-Exome Sequencing of Congenital Glaucoma Patients Reveals Hypermorphic Variants in GPATCH3, a New Gene Involved in Ocular and Craniofacial Development. Sci Rep 2017 [GPATCH3]

Ziploc-ing the Structure 2.0: endoplasmic reticulum resident peptidyl prolyl isomerases show different activities toward hydroxyproline J. Biol. Chem. 2017 [FKBP2]

穿梭表达载体系统

为了满足不同标签的需求(不同的标签类型和/或不同的位点),OriGene设计了新型的穿梭表达载体系统(PrecisionShuttle™),便于ORF序列从一个标签载体更换到另一个标签载体的亚克隆实验。TrueORF Entry载体包括C末端的Myc/DDK*标签,是穿梭表达载体系统的通用载体。OriGene提供大量的 目的载体,您可以用于表达带有不同标签的ORF克隆,或者表达在蛋白的不同末端,或者是表达天然的未标记的蛋白。

穿梭载体系统的关键是利用了两个稀有的限制性内切酶,Sgf I 和 Mlu I。通用载体和所有的目的载体具有相同的多克隆位点,因此他们可以通过简单的限制性酶切和连接,更换插入片段。在TrueORF通用载体中,ORF两侧是Sgf I位点(5’末端)和Mlu I位点(3’末端)。用这两种酶进行酶切,可以释放未标记的ORF克隆,再将其连接到用相同的酶切过的目的载体中。所有的目的载体带有氨苄抗性,代替通用载体上的卡那霉素抗性标记,穿梭成功的产品可以用氨苄很容易的筛选出来。

穿梭载体系统示意图

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超过96%的人源ORFs不具有Sgf I或Mlu I位点,适用于以上策略。其他4%的人源ORFs,包含其中的一个或两个酶切位点,因此在多克隆位点区的其他两个限制性酶切位点,可用于穿梭ORF到目标载体。此种情况出现时,在相关TrueORF的描述中可以找到提示信息。

与常见的Gateway系统相比,穿梭表达系统具有几个明显优势:

  1. 通用载体可用于哺乳动物细胞和无细胞系统的标记性表达。可满足多数应用,无须将ORF更换到目的载体。
  2. 该系统具有简便的酶切和酶连系统,不需要额外购买昂贵的特殊连接酶。
  3. 使用简单方便。
  4. 该系统可轻松穿梭18kb大的ORFs片段,而通常的再连接体系只能稳定连接小于4kb的ORFs片段。
  5. 穿梭载体的标签精确添加在目标位点,不会在蛋白的两端产生多余的氨基酸。

* DDK-标签(Flag®)的多肽序列: N-DYKDDDDK-C Flag® 是 Sigma-Aldrich公司注册的商标。

 

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